Al entronizarse la Casa de Austria con Carlos I, en la primera mitad del siglo XVI, cada compañía lleva su propia bandera en la que figuraban, normalmente, las armas de su capitán sobre el Aspa de Borgoña. Para representar al Rey, solían llevar otra, la principal, que era de seda amarilla (uno de los colores de los Austrias) con el Escudo Imperial bordado.
Las armas de Carlos I añaden a las de Castilla, León, Aragón, Dos Sicilias y Granada, presentes en el escudo anterior, las de Austria (de gules y una faja de plata), Borgoña antiguo (bandado de oro y azur con bordura de gules), Borgoña moderno (de azur, sembrado de flores de lis de oro y bordura campo nada, cantonada de plata y gules), Brabante (de sable y un león de oro, coronado de lo mismo, lenguado y armado de gules), Flandes (de oro y un león de sable, lenguado y armado de gules) y Tirol (partido de plata y un águila de gules, coronada, picada y membrada de oro, cargado el pecho de un creciente trebolado de lo mismo). Carlos I incorpora también las Columnas de Hércules con la leyenda "Plus Ultra", en representación del Imperio ultramarino, y rodea el escudo con el collar del Toisón de Oro, como soberano de dicha Orden.